2021年10月15日，客服中心反馈某集团客户有药物筛选的研发测试需求，通过研究30种中药提取物对神经细胞TRVP1通道的抑制影响，从而验证植物提取物是否具有止痒、止痛效果。生物实验室工程师第一时间与客户进行详细沟通，情况如下：

客户背景

某集团公司从一个资产不足300万元的生产企业成长为一个总资产76.3亿多，总销售收入逾100亿元（2010年末），经营涉及化学原料药、化学药制剂、中成药、中药材、生物制品、保健食品、化妆品及饮料的研制、生产及销售；医疗器械（二类、医用敷料类、一次性使用医疗卫生用品），日化用品等领域的云南省实力最强、品牌最优的大型医药企业集团。

样品名称

中药提取物

客户需求

客户研究目的是对原料中药进行药物靶点筛选，通过细胞毒性测试、膜片钳、钙成像等技术手段，从多种提取物种筛选出能搞有效抑制TRVP1靶点的样品，进行后续下游的工艺研发生产。

解决方案

签订合同后，生物医药实验室先进行查阅大量文献，进行总体方案设计。TRPV1通道蛋白在广泛表达于Aδ-纤维及C-型纤维等皮肤感觉神经纤维上，激活感觉神经元上TRPV1受体，可产生疼痛、灼热及瘙痒感，并引起P物质(Substance P，SP)和降钙素基因相关肽(Calcitonin Gene Related Peptide，CGRP)等促炎介质的释放，介导神经源性的炎症，最终导致多种皮肤病和瘙痒症的发生。该发现获得了 2021年诺贝尔生理学或医学奖获奖。本次实验就针对TRPV1靶点，?进行3个主要药效学实验，详情如下。

细胞毒性测试：

CCK-8试剂在电子载体1-甲氧基 -5-甲基吩嗪 硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物（Formazan），生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。

测试中，对样品设置6-8个浓度梯度，利用DRG细胞进行30种中药提取物样品的细胞毒性测试， 根据酶标仪原始读数计算样品特定浓度下的细胞活力，从而计算出样品对细胞的半致死浓度（CC50），评价药物对细胞的毒性作用。经过该项测试，选取细胞活力为80%的样品浓度作为后续实验的测试最高浓度开展项目实验。

膜片钳：

膜片钳又称单通道电流记录技术，用特制的玻璃微吸管吸附于细胞表面，可测量单个离子通道开放产生的pA量级的电流，这种通道开放是一种随机过程。通过观测单个通道开放和关闭的电流变化，可直接得到各种离子通道开放的电流幅值分布、开放几率、开放寿命分布等功能参量，并分析它们与膜电位、离子浓度等之间的关系，广泛用于药物对离子通道受体抑制作用的测试。

测试中，在室温下用全细胞膜片钳技术记录相应激动剂诱发的通道电流。玻璃微电极由玻璃电极毛胚（BF150-86-10，Sutter）经拉制仪（P97，Sutter）拉制而成，灌注电极内液后的尖端电阻为2-5 MΩ左右，将玻璃微电极插入放大器探头即可连接至膜片钳放大器。钳制电压和数据记录由pClamp软件通过电脑控制和记录，采样频率为10 kHz，滤波频率为2 kHz。在得到全细胞记录后，细胞钳制在0 mV，300 ms斜坡电压从-100 mV至+100 mV，每2 s施加此电压刺激并给予激动剂诱发通道电流，电流诱发40 s以上并确定无衰减后开始给药过程。每个测试浓度至少给予20 s。数据分析处理采用pClamp，GraphPad Prism 5和Excel软件。不同化合物浓度对TRPV1通道电流（+100 mV时诱发的电流幅度）的抑制程度用以下公式计算：

Inhibition % = [1 –（I / Io）] × 100%

其中，Inhibition % 代表化合物对电流的抑制百分率，I和Io分别表示在加药后和加药前电流的幅度，评价中药提取物样品对该通道的抑制作用。

钙成像：

用荧光探针标记样本中的钙离子,根据样本中的荧光探针特性单色光源发出单色光,诱发出荧光。然后根据传感器检测到的荧光特性即可分析样本中的钙离子浓度。探针与钙结合后不仅产生荧光强度的变化，从而检测细胞中钙离子的浓度变化。

采用高内涵蔡司荧光显微镜仪器进行荧光信号记录，20倍的物镜，曝光100 ms和200 ms各记录1次加激动剂刺激前的，然后开始加入5激动剂化合物，测试样品荧光强度的变化。

客户反馈

在测试过程中和客户保持沟通，虽然在细胞复苏、培育阶段出了一点问题，但是客户总体比较满意。